Estandarización de PCR-RFLP para la caracterización molecular de genotipos de Blastocystis spp. en muestras de heces humanas

Antecedentes

Blastocystis spp. es el único Stramenopile que parasita el intestino humano. Se han identificado 17 subtipos (STs) en distintos hospederos, de los cuales del ST 1 al 9 se han encontrado en humanos, con o sin síntomas. Aunque su morfología es similar independientemente del hospedero y St, su diversidad genética ha sido demostrada mediante Técnicas de Biología Molecular. Estas técnicas deben ser estandarizadas para preservar la integridad del ADN, durante el proceso de extracción a partir de heces, para así asegurar la genopificación del parásito.

Objetivo

Estandarizar la PCR-RFLP para la caracterización molecular de los subtipos de Blastocystis spp. en muestras de heces humanas.

Metodología

63 muestras
– 33 heces totales (HT), 22 heces lavadas (HL)
– 8 sedimentos cultivos de Boeck (CL)

Extracción de ADN:
– Wizard®, Wizard Genomic® y DNAzol®, solos o combinados.

Evaluación de la calidad del ADN
– Pureza: 260/280 Concentración: 260 nm
– Contaminantes: 230 nm

PCR SSU 18S
– 1780 pb y 310 pb (Sensibilidad y especificidad)

RFLP (1780 pb)
– Hinf I, Rsa I (Yoshikawa et al., 2000)

Resultados

• Se observó el mejor índice 260/280 (alrededor de 2) y una absorbancia menor de 0,5 a 230 nm, al extraer el ADN a partir de CL, con el método de Wizard®, solo o combinado.
• La PCR de 1780 pb tuvo una sensibilidad de 0,3125 ng/μL de ADN y detectó hasta 1 Blastocystis /µL: La específicidad fue del 62,5%, corregida por la especificidad del 100% de la PCR de 310 pb.
• La amplificación por PCR de 1780 pb fue mayor (p<0,001) en las CL (87,5%; 7/8) y HL (68,2%;15/22), con respecto a las HT (21,2%; 7/33).
• Luego del RFLP de 20 amplificados, se obtuvo un 45% (9/20) para el St1, un 30% (6/20) para el St3, 10% (2/20) para el St4 y un 15% de infecciones mixtas (3/20).

Conclusiones/Recomendaciones

El método de extracción de Wizard®, con columna de sílica, permitió la obtención de un ADN de mejor calidad, a partir de los CL y HL, ya que los procesos de lavado previos, a la extracción, favorecen la eliminación de componentes que degradan la muestra de ADN y pueden inhibir la PCR.

La estandarización del PCR-RFLP permite identificar los Sts de Blastocystis sp. del 1 al 4, en infecciones únicas o mixtas, facilitando su estudio epidemiológico molecular, en diferentes poblaciones humanas.